本發(fā)明涉及干細(xì)胞培養(yǎng)，具體涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
1、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal?stem?cells,mscs)是一類來源于中胚層的成體干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化的潛能。研究表明mscs廣泛存在于成體及胎兒的各種組織中，如骨髓、外周血、脂肪組織、羊膜和臍帶、胎盤、牙髓、皮膚等中。
2、人臍帶的華通氏膠內(nèi)含有豐富的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，作為一種較原始的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有容易獲得、較低的免疫原性和多向分化的特點(diǎn)，成功避開了胚胎干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在使用過程中的諸多限制，從而被廣泛應(yīng)用。
3、人臍帶的結(jié)締組織是間充質(zhì)干細(xì)胞豐富的組織來源，目前臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法主要是剝離臍帶華通氏膠后酶解消化再培養(yǎng)傳代，但是在現(xiàn)有操作中常常存在酶解消化不穩(wěn)定的現(xiàn)象，酶解消化時(shí)間過長或酶濃度較高可能會損傷細(xì)胞膜，影響后續(xù)細(xì)胞傳代的活性；在此基礎(chǔ)上往往是通過降低酶濃度或者縮短酶消化時(shí)間來控制，但是消化處理時(shí)間較短也會造成細(xì)胞團(tuán)塊未完全分散消化不徹底的現(xiàn)象，影響后續(xù)傳代的細(xì)胞生長，在此基礎(chǔ)上增強(qiáng)細(xì)胞消化酶解的穩(wěn)定性，提升細(xì)胞傳代培養(yǎng)的效率是現(xiàn)階段間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的一大重要研究方向。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對現(xiàn)有技術(shù)不足，本發(fā)明提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，有效穩(wěn)定干細(xì)胞酶解消化環(huán)境，同時(shí)促進(jìn)后續(xù)傳代增殖的效率。
2、為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
3、一種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟：
4、s1、保護(hù)劑制備：將生理鹽水+10mm?hepes+2％海藻糖混合制成保護(hù)劑；
5、s2、傳代培養(yǎng)基的制備：dmem-f12培養(yǎng)基+10％胎牛血清+0.1mm軟脂酸鈉+fgf-25ng/ml制備得到傳代培養(yǎng)基；
6、s3、樣本分離：分離臍帶華通氏膠后離心切段得組織塊；
7、s4、組織接種培養(yǎng)：將組織塊干貼培養(yǎng)后加入dmem-f12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10-14d；
8、s5、原代細(xì)胞消化：除去培養(yǎng)基和貼壁的組織塊，后加入上述保護(hù)劑浸潤后處理20-30min，再添加消化液進(jìn)行消化處理2-3min，終止消化，過濾離心得原代間充質(zhì)干細(xì)胞；
9、s6、細(xì)胞接種：將上述原代間充質(zhì)干細(xì)胞重懸后按照4000～8000個(gè)/cm2的密度接種于培養(yǎng)瓶中，采用傳代培養(yǎng)基培養(yǎng)；
10、s7、傳代培養(yǎng)：培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到85％-90％，除去培養(yǎng)基，加入上述保護(hù)劑浸潤后處理20-30min，再添加消化液進(jìn)行消化處理2-3min，終止消化，過濾離心后重懸重復(fù)s6-s7步驟進(jìn)行傳代。
11、優(yōu)選的，所述步驟s3中的具體操作方式包括以下步驟：
12、s3-1、將臍帶樣本消毒后除去血凝塊，后生理鹽水清洗干凈；
13、s3-2、縱向剖開臍帶，剔除臍靜脈和臍動脈，撕取華通氏膠于裝有生理鹽水的50ml離心管中；
14、s3-3、將上述離心管在1500rpm，離心10min，除去生理鹽水，將剩余華通氏膠組織切成大小為1-3mm2的組織塊。
15、優(yōu)選的，所述步驟s4中的具體操作方式包括以下步驟：
16、s4-1、將組織塊均勻的接種在t175瓶中，滴加dmem-f12培養(yǎng)基使組織塊保持潤濕狀態(tài)，接種后，于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中靜置1h進(jìn)行干貼；
17、s4-2、向t175瓶中加入dmem-f12培養(yǎng)基至組織塊完全浸沒，繼續(xù)在37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-14d。
18、優(yōu)選的，所述步驟s4-1中接種的組織塊為3～5ml，間距在0.5±0.1cm。
19、優(yōu)選的，所述步驟s4-2的培養(yǎng)過程中根據(jù)組織塊濕潤程度及時(shí)進(jìn)行補(bǔ)液，若培養(yǎng)基顏色變黃則進(jìn)行換液。
20、優(yōu)選的，所述步驟s5和s7中的消化液的配方為：0.25％胰酶+0.02％edta+無ca2+/mg2+的pbs。
21、優(yōu)選的，所述步驟s5和s7中終止消化的方式為添加消化液3倍體積以上的10％胎牛血清+dmem-f12培養(yǎng)基混合溶液。
22、優(yōu)選的，所述步驟s5和s7中過濾離心的操作為采用細(xì)胞篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，后在1500rpm轉(zhuǎn)速下離心10min。
23、優(yōu)選的，所述傳代培養(yǎng)的條件為37℃，5％co2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。
24、本發(fā)明提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比優(yōu)點(diǎn)在于：
25、本發(fā)明在進(jìn)行酶解消化前采用保護(hù)劑對組織細(xì)胞進(jìn)行浸潤，能夠有效控制細(xì)胞后續(xù)酶解消化時(shí)受損，保證細(xì)胞的活性，提高細(xì)胞分離效率，獲得高活率的細(xì)胞，便于后續(xù)的傳代培養(yǎng)，同時(shí)在培養(yǎng)基中添加一定量的軟脂酸鈉能夠有效促進(jìn)細(xì)胞的傳代增殖。
1.一種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟s3中的具體操作方式包括以下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟s4中的具體操作方式包括以下步驟：
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟s4-1中接種的組織塊為3～5ml，間距在0.5±0.1cm。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟s4-2的培養(yǎng)過程中根據(jù)組織塊濕潤程度及時(shí)進(jìn)行補(bǔ)液，若培養(yǎng)基顏色變黃則進(jìn)行換液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟s5和s7中的消化液的配方為：0.25％胰酶+0.02％edta+無ca2+/mg2+的pbs。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟s5和s7中終止消化的方式為添加消化液3倍體積以上的10％胎牛血清+dmem-f12培養(yǎng)基混合溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟s5和s7中過濾離心的操作為采用細(xì)胞篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，后在1500rpm轉(zhuǎn)速下離心10min。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述傳代培養(yǎng)的條件為37℃，5％co2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。