本發(fā)明涉及生物化工領(lǐng)域，具體涉及一種胞二磷膽堿的酶催化合成領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、胞二磷膽堿(cytidine?diphosphate?choline或cdpc)，為卵磷脂生物合成的重要中間產(chǎn)物，本品鈉鹽為白色或類(lèi)白色粉末，無(wú)臭，易吸濕。本品在水中易溶，在乙醇、丙酮、氯仿中不溶。屬于核苷類(lèi)化合物，沸點(diǎn)為851.4℃at?760mmhg，分子式為c14h26n4o11p2，分子量為488.324，主要用于顱腦外傷和腦手術(shù)后的代謝障礙、意識(shí)障礙、震顫麻痹、神經(jīng)性耳聾和耳鳴，以及安眠藥中毒等。另對(duì)帕金森綜合征、腦血栓半身麻痹亦有較好療效。在大腦中，胞磷膽堿是一個(gè)重要的神經(jīng)遞質(zhì)-乙酰膽堿的前體，乙酰膽堿在記憶和學(xué)習(xí)過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。因此胞磷膽堿被認(rèn)為可能有助于改善記憶和認(rèn)知功能。

2、20世紀(jì)50年代kennedy等發(fā)現(xiàn)了胞二磷膽堿，隨后進(jìn)行化學(xué)合成并確定其分子結(jié)構(gòu)。rossiter在1957年發(fā)現(xiàn)胞二磷膽堿與磷脂代謝關(guān)系密切，是磷脂酰膽堿(卵磷脂)生物合成的重要輔酶。作為神經(jīng)保護(hù)藥物的研究開(kāi)發(fā)始于1963年，當(dāng)時(shí)由日本武田公司首次開(kāi)發(fā)出尼可林(nicholin,citicol-ine)，用于治療意識(shí)障礙獲得成功。

3、其合成方法主要為化學(xué)合成法：利用cmp(5’-胞苷酸)和磷酸膽堿作為反應(yīng)物，對(duì)甲苯磺酰氯為縮合劑，在n-二甲基甲酰胺存在下縮合成胞二磷膽堿鈉，缺點(diǎn)在于化學(xué)合成存在反應(yīng)轉(zhuǎn)化率低，生產(chǎn)成本較高，副產(chǎn)物多，易造成環(huán)境污染。微生物發(fā)酵法：利用酵母菌或產(chǎn)氨短桿菌等微生物利用葡萄糖，并添加cmp等提前發(fā)酵物生成胞二磷膽堿鈉，缺點(diǎn)在于產(chǎn)物濃度低，產(chǎn)率不穩(wěn)定。酶促合成法：抽提細(xì)胞液用胞苷三磷酸和磷酸膽堿生物合成胞二磷膽堿鈉，但是需要使用底物ctp，從而造成合成成本較高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種生物酶法合成胞二磷膽堿的方法。該方法以胞苷酸、氯化磷酸膽堿鈣鹽、乙酰磷酸二銨鹽為原料，在胞苷酸激酶和胞苷酸磷酸膽堿轉(zhuǎn)移酶共同催化下反應(yīng)得到胞二磷膽堿。該工藝所需原料來(lái)源廣泛，價(jià)格便宜，反應(yīng)步驟簡(jiǎn)單，產(chǎn)量高且反應(yīng)過(guò)程溫和。

2、本發(fā)明所述一種生物酶法合成胞二磷膽堿的方法，包括如下步驟：以胞苷酸、氯化磷酸膽堿鈣鹽、乙酰磷酸二銨鹽為原料，在胞苷酸激酶和胞苷酸磷酸膽堿轉(zhuǎn)移酶共同催化下反應(yīng)得到胞二磷膽堿。

3、進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，所述胞苷酸激酶的序列為序列表中，seq?id?no.1所示的核苷酸序列。

4、seq?id?no.1

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16、進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，所述胞苷酰磷酸膽堿轉(zhuǎn)移酶的序列為序列表中，seq?id?no.2所示的核苷酸序列。

17、seq?id?no.2

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50、進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，所述反應(yīng)溫度為25-35℃，采用ph＝6.0-8.0條件下進(jìn)行。

51、進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，所述反應(yīng)在mg2+存在條件下進(jìn)行。

52、進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，胞苷酸激酶制備為，菌種活化后制備種子液，以2-10％接種量接種至發(fā)酵罐，進(jìn)行連續(xù)流高密度發(fā)酵培養(yǎng)。

53、進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，胞苷酰磷酸膽堿轉(zhuǎn)移酶的制備為，菌種活化制備種子液，以2-10％接種量接種至發(fā)酵罐，進(jìn)行連續(xù)流高密度發(fā)酵培養(yǎng)。

54、進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，整個(gè)合成過(guò)程具體包括，胞苷酸激酶制備、胞苷酰磷酸膽堿轉(zhuǎn)移酶的制備、偶聯(lián)轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

55、進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，所述胞苷酸80-100g/l，所述乙酰磷酸二銨鹽100-200g/l，氯化磷酸膽堿鈣鹽100-200g/l，所述氯化鎂1-5.5g/l。

56、進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，所述乙酰磷酸二銨為液體型試劑。

57、進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，所述胞苷酸激酶和胞苷酰磷酸膽堿轉(zhuǎn)移酶形式包括但不局限于酶液、酶凍干粉、含酶細(xì)胞以及各種固定化酶和固定化酶細(xì)胞。例如也可以是未經(jīng)純化的粗酶形式、經(jīng)部分純化或完全純化的形式。

58、本發(fā)明有益效果

59、1、生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)底物

60、該生物轉(zhuǎn)化合成胞二磷膽堿的底物為胞苷酸，底物原料是以乙酰磷酸二銨鹽，氯化磷酸膽堿鈣鹽，極大降低了生產(chǎn)成本。

61、2、轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系

62、該工藝合成目標(biāo)產(chǎn)物胞苷二磷酸所用反應(yīng)體系是以純化水作為反應(yīng)體系直接進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，成本低廉、對(duì)環(huán)境友好、易操作、易產(chǎn)業(yè)化。

63、3、生產(chǎn)效率高

64、該合成技術(shù)以純化水為溶劑，不需要緩沖體系直接進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)合成產(chǎn)物胞二磷膽堿，與文獻(xiàn)報(bào)道相比該工藝目的產(chǎn)物積累濃度高，合成液中cdpc達(dá)到89.26g/l，工藝過(guò)程簡(jiǎn)單、原料來(lái)源方便，成本低廉、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)物收率高、可操作性強(qiáng)，易于產(chǎn)業(yè)化。