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一種富集突變多態(tài)性位點序列的方法

文檔序號:42300380發(fā)布日期:2025-06-27 18:42閱讀:21來源:國知局

本發(fā)明屬于核酸檢測,尤其涉及一種富集突變多態(tài)性位點序列的方法。


背景技術(shù):

1、單核苷酸多態(tài)性(snp)主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的dna序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種,占所有已知多態(tài)性的90%以上。snp在人類基因組中廣泛存在,平均每300個堿基對中就有1個,估計其總數(shù)可達300萬個甚至更多,是人群中個體差異最具代表性的dna多態(tài)性,相當(dāng)一部分還直接或間接與個體的表型差異、對疾病的易感性或抵抗能力、對藥物的反應(yīng)性等相關(guān)。snp被認為是一種能穩(wěn)定遺傳的早期突變。

2、snp檢測可用于多種疾病的早期篩查、診斷及預(yù)后判斷。目前snp檢測主要通過高通量測序和熒光pcr的方法進行檢測。高通量測序價格昂貴,對低突變頻率的樣本檢測缺乏靈敏度。熒光pcr廣泛應(yīng)用于已知突變基因檢測,利用特異的引物和探針來檢測突變基因。熒光pcr檢測突變位點數(shù)量小,難以滿足現(xiàn)有的多位點檢測要求。通過多重pcr的方式雖然可以提升熒光pcr檢測的位點數(shù),但腫瘤患者血漿dna的片段大小在160bp左右,一些檢測位點在探針和引物的設(shè)計上具有一定的挑戰(zhàn),多重pcr也會降低檢測結(jié)果的靈敏度和特異性。腫瘤基因樣本中存在大量的正常序列,現(xiàn)有的熒光pcr檢測方法對低突變頻率的樣本靈敏度很差。


技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點和不足,本發(fā)明的目的在于提供一種富集突變多態(tài)性位點序列的方法。

2、本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的,一種富集突變多態(tài)性位點序列的方法,該方法包括以下步驟:

3、(1)以5’末端磷酸化的選擇子作為引物,在dna合成酶及其對應(yīng)的緩沖液單種dntp或可逆終止dntp構(gòu)成的混合物條件下,以待測核酸樣本為模板進行單堿基延伸;

4、(2)加入t4?dna連接酶緩沖液,90℃加熱變性1分鐘,冰上放置2分鐘進行分子內(nèi)復(fù)性,形成開環(huán)結(jié)構(gòu)的核酸分子;

5、(3)加入t4?dna連接酶,在所延伸的堿基與選擇子上的堿基信息一致時連接成環(huán);

6、(4)加入核酸外切酶,消化未連接成環(huán)的dna。

7、優(yōu)選地,在步驟(1)中,所述可逆終止dntp選自datp、dttp、dctp、dgtp四種的可逆終止dntp中的一種或多種混合物。

8、優(yōu)選地,在步驟(1)中,若混合物中含有可逆終止dntp且為可逆終止3'-onh2-dntp時,對所述可逆終止dntp進行預(yù)處理以恢復(fù)3’末端羥基。

9、優(yōu)選地,對所述可逆終止dntp進行預(yù)處理以恢復(fù)3’末端羥基具體為:用去保護劑在室溫處理10分鐘,恢復(fù)3’末端羥基,純化并回收中間產(chǎn)物。

10、優(yōu)選地,所述去保護劑為0.7m?naoac和1.0m?nano2,ph?5.2。

11、優(yōu)選地,在步驟(1)中,所述單種dntp選自datp、dttp、dctp、dgtp中的任意一種。

12、優(yōu)選地,在步驟(1)中,所述dna聚合酶包括但不限taqdna聚合酶和pfudna聚合酶。

13、優(yōu)選地,步驟(4)具體為:加入10單位的核酸外切酶i(neb)和100單位的核酸外切酶iii(neb)室溫處理15分鐘。

14、本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種富集突變多態(tài)性位點序列的方法。選擇子是一段具有結(jié)構(gòu)dna的引物,如圖1所示,由以下幾部分組成:(1)5’末端的環(huán)部區(qū),環(huán)部區(qū)序列可以是一段由18~30個堿基組成的公用引物1序列(即所有待檢測的snp都一樣),也可以是一段編碼不同snp位點的核酸序列(即每一個snp對應(yīng)有一段核酸序列,該段核酸序列由10~20個堿基組成);(2)5’末端的莖部區(qū),莖部至少含有5個堿基的配對區(qū);(3)緊接著是snp位點堿基信息,(4)然后是4~8個堿基,優(yōu)選4個堿基,是選擇子3’末端反向互補序列;(5)然后是公共引物2,公共引物2視最后檢測手段可以缺少,(6)緊接著是一段特異引物序列,其延伸的第一個堿基是snp的堿基信息。

15、在本發(fā)明中,選擇子上緊鄰5’末端環(huán)區(qū)的第一個堿基是待檢測的突變堿基信息,緊接著是位于3’末端特異引物最后4個堿基的反向互補序列,當(dāng)選擇子與待測模板進行單堿基延伸(用一套可逆終止dntp或單個普通dntp),如果選擇子延伸的堿基正好與選擇子上待檢測的突變堿基信息是互補關(guān)系,那么單堿基延伸后的選擇子可形成可連接成環(huán)的中間體,然后進行連接和后期的檢測(可用基因芯片或二代測序進行檢測)。

16、相比于現(xiàn)有技術(shù)的缺點和不足,本發(fā)明具有以下有益效果:

17、(1)多重pcr或基于多重pcr的bda法,極限檢測重數(shù)受到很大的限制,而本發(fā)明采用單引物的延伸反應(yīng),單管反應(yīng)所能富集的重數(shù)可參考探針雜交捕獲技術(shù),理論可達一萬甚至幾萬個靶點;

18、(2)基于探針捕獲技術(shù)maestro重數(shù)比目前流行技術(shù)有優(yōu)勢,但是需要提前建庫,會丟失部分信息,而本發(fā)明(與maestro類似,都是通過單引物/探針雜交)可不犧牲重數(shù)的基礎(chǔ),無需提前建庫,而且在富集過程可通過多輪單引物延伸,使突變信息呈幾十倍的富集;

19、(3)早期的分子倒置探針(molecularinversionprobe,mip)基因分型技術(shù),需要長度超過100nt的探針(超過90nt的引物合成每個堿基的合成費用倍增),而且mip需要探針兩端同時與靶點結(jié)合才能有效進行,但探針與模板存在只有一端結(jié)合或兩個不同的探針結(jié)合到同一個靶點上的無效結(jié)合(考慮cfdna長度只有160nt,如果突變位點位于兩端,那么這些模板是不能被富集),更重要的是mip每一輪缺口補齊都需要三十分鐘,難以進行多輪擴增,而本發(fā)明需要合成的探針70nt左右,只涉及單端引物的延伸可在幾秒內(nèi)完成并可通過增加循環(huán)數(shù)進行倍數(shù)富集,后期的延伸或連接反應(yīng)都可以在幾分鐘內(nèi)完成,通過本發(fā)明方法,使用標(biāo)準(zhǔn)的實驗室設(shè)備就可以在一個pcr管中對超1000多個探針進行多重分析。



技術(shù)特征:

1.一種富集突變多態(tài)性位點序列的方法,其特征在于,該方法包括以下步驟:

2.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,在步驟(1)中,所述可逆終止dntp選自datp、dttp、dctp、dgtp四種的可逆終止dntp中的一種或多種混合物。

3.如權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于,在步驟(1)中,若混合物中含有可逆終止dntp且為可逆終止3'-onh2-dntp時,對所述可逆終止dntp進行預(yù)處理以恢復(fù)3’末端羥基。

4.如權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于,對所述可逆終止dntp進行預(yù)處理以恢復(fù)3’末端羥基具體為:用去保護劑在室溫處理10分鐘,恢復(fù)3’末端羥基,純化并回收中間產(chǎn)物。

5.如權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于,所述去保護劑為0.7m?naoac和1.0m?nano2,ph5.2。

6.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,在步驟(1)中,所述單種dntp選自datp、dttp、dctp、dgtp中的任意一種。

7.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,在步驟(1)中,所述dna聚合酶包括但不限taqdna聚合酶和pfudna聚合酶。

8.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,步驟(4)具體為:加入10單位的核酸外切酶i和100單位的核酸外切酶iii室溫處理15分鐘。


技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種富集突變多態(tài)性位點序列的方法,本發(fā)明以5’末端磷酸化的選擇子作為引物,在DNA合成酶及其對應(yīng)的緩沖液單種dNTP或可逆終止dNTP構(gòu)成的混合物條件下,以待測核酸樣本為模板進行單堿基延伸;加入T4DNA連接酶緩沖液,90℃加熱變性1分鐘,冰上放置2分鐘進行分子內(nèi)復(fù)性,形成開環(huán)結(jié)構(gòu)的核酸分子;加入T4DNA連接酶,在所延伸的堿基與選擇子上的堿基信息一致時連接成環(huán);加入核酸外切酶,消化未連接成環(huán)的DNA。本發(fā)明無需提前建庫,而且在富集過程可通過多輪單引物延伸,使突變信息呈幾十倍的富集;本發(fā)明只涉及單端引物的延伸可在幾秒內(nèi)完成并可通過增加循環(huán)數(shù)進行倍數(shù)富集,后期的延伸或連接反應(yīng)都可以在幾分鐘內(nèi)完成。

技術(shù)研發(fā)人員:李燕強,韓文燦,劉清華,郭羽白
受保護的技術(shù)使用者:徐州醫(yī)科大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日:
技術(shù)公布日:2025/6/26
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