本發(fā)明屬于植物基因工程育種，具體涉及一種花粉細(xì)胞特異表達(dá)調(diào)控花粉育性的基因ossyp71b，以及該基因在單子葉植物水稻雜交育種中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、水稻(oryza?sativa?l.)是世界上最重要的糧食作物之一，全世界一半以上的人口以大米為主食。利用雜種優(yōu)勢的雜交育種使得水稻產(chǎn)量大幅提升，作為自花授粉、雌雄同花的植株，水稻雜交育種需要先創(chuàng)制雄性不育系，目前水稻中常用的雜交育種方式是以cms(cytoplasmic?male?sterility)系為基礎(chǔ)的“三系法”育種和以ptgms(photo-thermosensitive?genic?male?sterile?line)系為基礎(chǔ)的“兩系法”育種(wu?et?al.,2016.development?ofa?novel?recessive?genetic?male?sterility?system?for?hybridseed?production?in?maize?and?other?cross-pollinating?crops.plantbiotechnology?journal,14:1046–1054.)。

2、基于花粉育性調(diào)控的雄性不育材料創(chuàng)制是水稻雜交育種的關(guān)鍵，研究在花粉發(fā)育過程中的相關(guān)調(diào)控基因能更好的揭示雄性育性維持分子機(jī)理，雄性不育基因的不斷挖掘有利于雜種優(yōu)勢的利用及水稻產(chǎn)量的提高。

3、雖然在擬南芥中，syp72基因突變后，突變體花粉活力明顯下降，且花粉在水合過程中不能維持細(xì)胞的完整性，導(dǎo)致花粉破裂不能萌發(fā)。在水稻中，syp72的同源基因的功能并不清楚。(zhou?x,et?al.2022.syp72?interacts?with?the?mechanosensitive?channelmsl8?to?protect?pollen?from?hypoosmotic?shock?during?hydration.naturecommunications,13:73.)。目前水稻雄性不育基因的研究主要依托于ems誘變，根據(jù)花粉不育的表型探究相關(guān)基因。水稻中syp72同源基因的功能未知。

4、水稻雄性不育作為水稻雜交育種的核心環(huán)節(jié)，對其不育基因的克隆和功能分析，不僅能解析水稻顯性雄性核不育形成的遺傳機(jī)理，進(jìn)一步完善水稻雄性不育遺傳機(jī)制，同時也為水稻雄性不育的應(yīng)用提供了基因資源和理論依據(jù)。無論從豐富水稻育性資源，還是提升育種效率，對水稻雄性不育基因的研究都顯得重要而迫切。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的第一個目的是提供一種水稻中調(diào)控花粉活力及用于創(chuàng)建水稻雄性不育系的新基因。

2、本發(fā)明的第二個目的是提供一種水稻中調(diào)控花粉活力及用于創(chuàng)建水稻雄性不育系的新蛋白。

3、本發(fā)明的第三個目的是提供一種產(chǎn)生水稻雄性不育的方法。

4、本發(fā)明的第四個目的是花粉特異表達(dá)基因和蛋白在育種中的應(yīng)用。

5、本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案給予實(shí)現(xiàn)的：

6、本發(fā)明公開了一種水稻花粉特異表達(dá)基因ossyp71b，其核苷酸序列如seq?idno.1所示，該基因在花粉中特異性表達(dá)，敲除或沉默該基因可導(dǎo)致水稻雄性不育。

7、本發(fā)明中公開的水稻花粉特異表達(dá)基因ossyp71b，通過crispr/cas9技術(shù)敲除或沉默ossyp71b基因，導(dǎo)致水稻雄性不育。

8、本發(fā)明還公開了一種水稻花粉特異性表達(dá)蛋白，該蛋白的氨基酸序列如seq?idno.2所示，通過crispr/cas9技術(shù)敲除或沉默ossyp71b基因，構(gòu)建敲除或沉默突變體，導(dǎo)致水稻雄性不育。

9、本發(fā)明還公開了一種制備ossyp71b突變體水稻植株的方法，其步驟包括：構(gòu)建ossyp71b敲除質(zhì)粒，將其以水稻日本晴為背景進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得ossyp71b突變體植株。

10、進(jìn)一步的，所述的制備ossyp71b突變體水稻植株的方法，其步驟包括：

11、①根據(jù)ossyp71b的基因序列，使用在線網(wǎng)站crispr-p2.0分析敲除位點(diǎn)，選擇評分較高且位置合適的兩個靶點(diǎn)；

12、靶點(diǎn)序列：

13、t1：5’-ccgtcgaggtcgatcgatca-3’，

14、t2：5’-ccaagaaggtgaccggaact-3’；

15、②根據(jù)靶點(diǎn)序列和sgrna表達(dá)盒的載體序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，以u6a-f、dt1-r為配對引物擴(kuò)增u6a啟動子片段，以dt1-f、dt2-r為配對引物擴(kuò)增u6b啟動子片段，以dt2-f、sg-r為配對引物擴(kuò)增sgrna片段，

16、引物序列：

17、u6a-f:atatatggtctcgctcgtggaatcggcagcaaagg，

18、sg-r:atatatggtctcgaccgtccatccactccaagctc，

19、dt1-f:atatatggtctcggtcgatcgatcagttttagagctagaaata，

20、dt1-r:atatatggtctcgcgacctcgacggcggcagccaagccagca，

21、dt2-f:atatatggtctcggtgaccggaactgttttagagctagaaata，

22、dt2-r:atatatggtctcgtcaccttcttggcaacacaagcggcagcg；

23、③利用酶切連接將片段與mh質(zhì)粒連接起來，構(gòu)建完成的mh敲除載體以水稻日本晴為背景進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得ossyp71b突變體植株。

24、更進(jìn)一步，本發(fā)明公開了構(gòu)建possyp71b::gus表達(dá)模式分析載體并進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，篩選陽性株系后，通過gus染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ossyp71b是一個花粉特異表達(dá)基因的方法。該方法包括如下步驟：

25、①從水稻基因組中通過pcr擴(kuò)增possyp71batg前2989bp的啟動子區(qū)域，將possyp71b啟動子連入pc1300-gus載體，獲得possyp71b::gus表達(dá)模式分析載體；

26、②將possyp71b::gus表達(dá)模式分析載體送往伯遠(yuǎn)生物公司進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因植株；

27、③通過gus染色篩選花粉中表達(dá)gus信號的植株，即陽性植株；

28、④在hygr上設(shè)計(jì)引物，對陽性植株基因組進(jìn)行pcr擴(kuò)增，篩選載體分離的陽性純合植株；

29、⑤對篩選到的陽性植株不同組織和花粉進(jìn)行g(shù)us染色，鑒定ossyp71b的表達(dá)模式。

30、進(jìn)一步的，本發(fā)明公開了通過crispr/cas9技術(shù)構(gòu)建水稻ossyp71b敲除突變株，篩選創(chuàng)建三個純合轉(zhuǎn)基因株系，并對突變體株系表型進(jìn)行分析的方法，結(jié)果證實(shí)ossyp71b基因突變會導(dǎo)致的水稻花粉活力顯著下降，在水合過程中破裂，結(jié)實(shí)率下降；這表明ossyp71b與花粉活力及結(jié)實(shí)率相關(guān)，為雄性不育系的創(chuàng)制和雜交種子制備提供借鑒。該方法包括以下實(shí)驗(yàn)步驟：

31、①通過邊切邊連的方法將靶點(diǎn)連接到mh質(zhì)粒中，熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，獲得mh-ossyp71b敲除載體；

32、②將mh-ossyp71b敲除載體送往伯遠(yuǎn)生物公司進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因植株；

33、③對轉(zhuǎn)基因植株提取基因組dna，針對靶點(diǎn)1和靶點(diǎn)2所在片段范圍進(jìn)行pcr擴(kuò)增和測序，根據(jù)測序結(jié)果與日本晴中的ossyp71b基因進(jìn)行比對。在靶點(diǎn)位置處具有特異性單峰特征的序列，且該序列發(fā)生堿基插入或缺失，則該株系為純合基因型；若靶點(diǎn)位置處具有雙峰特征的突變序列，則該株系為雜合基因型；

34、④通過在cas9位置設(shè)計(jì)引物，對t1代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行mh-ossyp71b敲除載體分離鑒定，篩選mh-ossyp71b敲除載體分離的純合基因型突變植株；

35、⑤對篩選到的純合基因型突變植株進(jìn)行表型鑒定，觀察突變植株花粉、結(jié)實(shí)率等表型，與野生型進(jìn)行對比；

36、⑥獲得ossyp71b突變體植株，該突變體花粉活力降低，結(jié)實(shí)率較低，花粉在水合過程中會出現(xiàn)破裂導(dǎo)致不能萌發(fā)。

37、進(jìn)一步的，本發(fā)明還公開了花粉特異表達(dá)基因syp72的同源基因在單子葉植物水稻中的功能，利用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)了可能是通過機(jī)械敏感離子通道蛋白發(fā)揮功能的。

38、本發(fā)明公開了的水稻花粉特異表達(dá)基因ossyp71b在制備水稻雄性不育系中的應(yīng)用。

39、本發(fā)明公開了水稻花粉特異性表達(dá)蛋白在制備水稻雄性不育系中的應(yīng)用。

40、在本發(fā)明中，“snare”是指soluble?n-ethylmaleimide-sensitive?factorattachmentprotein?receptors，即可溶性n-乙基馬來酰亞胺敏感性因子附著蛋白受體，是一種高度保守的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在植物、動物和微生物等物種的囊泡運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用。(gu?et?al.2020.vesicle?transport?in?plants:a?revised?phylogeny?of?snareproteins.evolutionary?bioinformatics?online,16:1612702879.)

41、本文使用的術(shù)語“syp72”是指擬南芥中syp72基因，其在花粉中特異性表達(dá)，突變后擬南芥植株花粉活力明顯異常，花粉水合過程中無法維持細(xì)胞完整性導(dǎo)致破裂，角果明顯變小，結(jié)實(shí)率顯著降低(zhou,et?al.2022.syp72interacts?with?themechanosensitive?channel?msl8?to?protect?pollen?from?hypoosmotic?shockduringhydration.nature?communications,13:73.)。

42、本文使用的術(shù)語“基因編輯(gene?editing)”，是一種較精確的能對生物體基因組靶基因進(jìn)行修飾的一種新興基因工程技術(shù)。該技術(shù)能夠?qū)δ繕?biāo)基因進(jìn)行定點(diǎn)“編輯”，實(shí)現(xiàn)對特定dna片段的修飾。基因編輯依賴于經(jīng)過基因工程改造的核酸酶，也稱“分子剪刀”，在基因組中特定位置產(chǎn)生位點(diǎn)特異性雙鏈斷裂(dsb)，誘導(dǎo)生物體通過非同源末端連接(nhej)或同源重組(hr)來修復(fù)dsb，因?yàn)檫@個修復(fù)過程容易出錯，從而導(dǎo)致靶向定點(diǎn)突變。

43、本文使用的術(shù)語“crispr/cas9”是指使用sgrna引導(dǎo)鏈靶向內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)的內(nèi)切核酸酶，一種近年廣為應(yīng)用的定點(diǎn)突變技術(shù)。

44、本文定義被子植物syp72同源基因是指具備以下特征的基因：

45、(1)具有snare蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域；

46、(2)編碼的蛋白具有分泌性。

47、(3)在花粉中特異性表達(dá)。

48、本發(fā)明中使用的生物材料，都可從公司購得，也可聯(lián)系武漢大學(xué)雜交水稻國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，或可從已發(fā)表的文章中獲取。

49、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

50、采用crispr/cas9技術(shù)在水稻中構(gòu)建ossyp71b的敲除突變體，揭示ossyp71b在花粉發(fā)育后期過程中的功能，為水稻雄性不育系的創(chuàng)建和雜交育種提供借鑒。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個方面：

51、(1)揭示了snare蛋白o(hù)ssyp71b在水稻花粉發(fā)育過程中所發(fā)揮的功能；

52、(2)證實(shí)了ossyp71b是一個花粉特異表達(dá)的基因，基因功能缺失會導(dǎo)致花粉活力顯著降低和結(jié)實(shí)率下降，對水稻雄性不育系系創(chuàng)制和雜交育種具有重要的借鑒意義。

53、(3)為揭示囊泡運(yùn)輸相關(guān)snare家族蛋白在單子葉植物水稻花粉發(fā)育過程中的生物學(xué)功能研究提供新思路。